Recombinase Polymerase Amplification หรือ RPA

Share on facebook
Share on google
Share on twitter
Share on email
RPA เป็นปฏิกิริยาที่ทำงานโดยใช้อุณหภูมิเดียว (isothermal) สามารถใช้ทดแทน PCR ได้ มีความสามารถในการเพิ่มจำนวนและตรวจสอบปริมาณ nucleic acid ที่ปกติต้องทำในห้องปฏิบัติการ เปลี่ยนมาให้ใช้ในภาคสนามได้สะดวกขึ้น

Recombinase Polymerase Amplification (RPA) เป็นเทคโนโลยี isothermal nucleic acid amplification ทำหน้าที่แทนเทคนิค polymerase chain reaction (PCR) ซึ่งช่วยให้กระบวนการเร็วขึ้น, สามารถพกพาได้, และตรวจวัดการเพิ่มขึ้นของ nucleic acid ได้ สามารถปรับใช้กับแอพพลิเคชั่นที่หลากหลายได้ เช่น การวินิจฉัยโรคติดเชื้อและการทดสอบการปนเปื้อนในอาหาร RPA นั้นเหมาะสมอย่างยิ่งกับการใช้ในภาคสนามและที่ๆมีทรัพยากรจำกัด โดยเฉพาะอย่างยิ่งในสถานการณ์ที่จำเป็นต้องขนส่งง่าย ใช้งานง่าย และในสถานการณ์ที่ต้องการความรวดเร็ว
RPA มีความเฉพาะเจาะจงเหมือนกับการใช้ PCR แต่เร็วกว่ามาก โดยทั่วไปผลลัพธ์จะเสร็จภายใน 3-10 นาที และแตกต่างจาก PCR เพราะปฏิกิริยา RPA ไม่จำเป็นต้องใช้ความร้อนหรือการละลายทางเคมีดังนั้นจึงไม่จำเป็นต้องมีเครื่อง thermoycler ราคาแพงหรืออุปกรณ์หรือรีเอเจนต์อื่นเพิ่มเติม
RPA ทำงานได้อย่างดีที่สุดที่อุณหภูมิประมาณ 37-42˚C ซึ่งต่ำกว่าการใช้เครื่อง thermocycler แต่ทำงานได้ในอุณหภูมิแวดล้อมได้ในช่วงกว้าง ถ้าบรรจุในรูปแบบ lyophilised เอนไซม์ RPA จะมีเสถียรภาพที่ดีเยี่ยม ที่อุณหภูมิโดยทั่วไปอย่างน้อย 12 เดือน การทำความเย็นสำหรับการขนส่งระยะสั้นไม่มีความจำเป็น
RPA สามารถใช้แทน PCR ได้ในแอพพลิเคชั่นที่หลากหลาย ผู้ใช้สามารถออกแบบชุดการทดสอบที่มีความอ่อนไหวเป็นพิเศษได้อย่างง่ายดายโดยใช้ primer ของตนเอง เทคโนโลยี RPA สามารถปรับใช้กับเทคนิคไมโครฟลูอิดิค, การไหลด้านข้างและอุปกรณ์อื่นๆได้ และถ้าใช้เอนไซม์ Reverse transcriptase ยังสามารถใช้เพื่อเพิ่มจำนวนและตรวจจับ RNA ได้ด้วย

RPA ทำงานอย่างไร?

ปฏิกิริยา RPA ใช้เอนไซม์ที่รู้จักกันในชื่อ recombinases ไปจับอยู่กับ oligonucleotide primers และจับคู่ primer ลำดับที่คล้ายคลึงกันในรูป duplex DNA  โปรตีนที่ชื่อ single-stranded DNA binding (SSB) จะไปแทรกจับสาย DNA เส้นหนึ่ง (displaced strand) และทำให้เกิดเป็น D loop  จากนั้น DNA amplification โดย polymerase นั้นจะเริ่มจาก primer แต่ก็จะจำเพาะต่อเป้าหมายเท่านั้น เมื่อเริ่มต้นแล้วปฏิกิริยาการเพิ่มจำนวนจะดำเนินไปอย่างรวดเร็ว ดังนั้นเมื่อเริ่มต้นด้วย DNA เพียงไม่กี่ชุด การเพิ่มจำนวน DNA ที่มีความเฉพาะเจาะจงสูงจะไปถึงระดับจำนวนที่ตรวจพบได้ภายในไม่กี่นาที

RPA – The versatile replacement to PCR

ข้อดีของการใช้ RPA (Recombinase Polymerase Amplification)?
  • เร็ว (Speed)RPA ทำงานเร็ว และอุณหภูมิปกติที่ทำงานได้ดีอยู่ในช่วง 37-42°C จำนวนโมเลกุลของ nucleic acid เริ่มต้นจำนวนไม่มาก สามารถเพิ่มจำนวนจนได้ปริมาณที่ตรวจวัดได้ ในเวลาเพียง 3-10 นาที ขึ้นอยู่กับขนาดของ DAN เป้าหมาย ในหลายกรณี บุคลากรเพียงคนเดียว ไม่จำเป็นต้องผ่านการอบรมพิเศษ สามารถเก็บตัวอย่าง เตรียมการ และดำเนินการทดสอบเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ได้ภายในครึ่งชั่วโมง เมื่อเทียบกับระยะเวลารอผล 24 ชั่วโมงของตัวอย่างทางคลินิกโดยปกติเนื่องจากต้องส่งตัวอย่างไปที่ห้องปฏิบัติการ
  • ความไว (Sensitivity)RPA สามารถเพิ่ม DNA จำนวนเริ่มต้นเพียง 1 เส้น หรือจำนวน RNA เริ่มต้นเพียง 10 เส้น ในตัวอย่างที่ซับซ้อนได้ โดยไม่ต้องมีขั้นตอนสกัด nucleic acid ก่อนหน้า
  • ความเฉพาะเจาะจง (Specificity)RPA มีความเฉพาะเจาะจงมาก สามารถจับ DNA ส่วนที่ต้องการได้ แม้มีเพียงโมเลกุลเดียวท่ามกลาง DNA ส่วนที่ไม่ต้องการเป็นร้อยนาโนกรัม หรือท่ามกลาง genomic DNA จากตัวอย่างที่มีสิ่งมีชีวิตปนกันอยู่มาก รวมทั้ง DNA ของคนด้วย
  • ทำงานที่อุณหภูมิต่ำ (Low temperature operation)RPA ทำงานในช่วง 37-42°C และไม่ต้องมีขั้นตอน melting DNA ในงานบางประเภท ถ้าจำเป็น RPA reaction สามารถทำได้โดยใช้อุณหภูมิจากร่างกายของเราเอง และยังทำงานได้แม้อุณหภูมิจะต่ำกว่านั้น แม้จะช้าลงบ้าง อย่างเช่นที่ที่อุณหภูมิห้องประมาณ 25°C ที่อุณหภูมินี้จะใช้เวลาประมาณ 1 ชั่วโมง
  • ทนต่อตัวอย่าง (Sample tolerance)RPA ใช้กับตัวอย่างได้กว้างขวาง สามารถใช้กับตัวอย่างที่ผสมกันอย่างซับซ้อน เช่นเลือด สารคัดหลั่งจากการป้ายจมูก หรือเชื้อที่เลี้ยงในอาหาร โดยไม่ต้องไปสกัด DNA ก่อน เพียงบางครั้งอาจจะทำวิธี pathogen lysis พื้นฐาน เช่น การทำให้ร้อน หรือใช้ด่างอ่อนๆ เพื่อให้ได้ nucleic acid ออกมา ทั้งนี้ขึ้นอยู่กับปัจจัยต่างกันตามแต่ความต้องการ เช่น ชนิดของ pathogen titre หรือมี inhibitors ซึ่งอาจจะต้องออกแบบวิธีการเพิ่มเติม
  • ประยุกต์ได้หลากหลาย (Broad applicability)RPA สามารถประยุกต์ใช้ได้กับทั้ง DNA และ RNA มีผู้ใช้งานได้รายงานการพัฒนาชุดทดสอบ ultra-high sensitivity, one-pot RNA detection assays โดยการใช้ reverse transcriptase
  • ทำปฏิกิริยาพร้อมกันได้ (Multiplexing)โดยการผสม multiple primers ในหลอดทดลองเดียว สามารถเพิ่มจำนวนและวัดผลเป้าหมายแตกต่างกันได้พร้อมกัน
  • ต้นทุนต่ำ (Low cost burden)RPA ต้องการเพียงเครื่องมือตรวจวัดพื้นฐาน ซึ่งหมายความว่าผู้ใช้งานสามารถออกแบบชุดทดสอบวินิจฉัยที่ใช้งานง่ายได้ โดยไม่ต้องซื้อ thermocycler ราคาแพง
  • การใช้งานที่ยืดหยุ่น (Flexible reaction formats)ส่วนประกอบหลักที่ทำให้เกิดปฏิกิริยามีความเสถียรในรูปแบบแห้ง ขนส่งและเก็บรักษาง่าย โดยไม่ต้องแช่เย็นได้นานถึง 12 เดือน หรือถ้าใช้ในรูปของเหลวก็จะเหมาะกับใช้ร่วมกับ PCR reagents ซึ่งสามารถปรับสัดส่วนปริมาณได้ตามต้องการ
  • สามารถตรวจสอบหลายเป้าหมายพร้อมกัน (Multiple detection formats)RPA สามารถประยุกต์ใช้ได้กับระบบตรวจสอบและเครื่องมือหลากหลาย รวมทั้ง fluorescence, real time probes และ sandwich assay formats

Cr.https://www.twistdx.co.uk/