พื้นฐานการสกัด DNA ด้วย Magnetic DNA Purification ตอนที่ 2

Share on facebook
Share on google
Share on twitter
Share on email
การสกัดสารพันธุกรรม (Nucleic Acid Isolation)

ความเข้าใจเกี่ยวกับสารพันธุกรรมของเราเพิ่มขึ้นอย่างมาก นับตั้งแต่ Friederich Miescher สกัด DNA เป็นครั้งแรกในปี 1869 เขาค้นพบว่ามีสารอยู่ภายในเซลล์ที่ตกตะกอนจากสารละลาย มีความเป็นกรดและละลายในสารละลายด่าง เขาเรียกมันว่านิวคลีอิน (Nuclein) เพราะมันดูเหมือนจะอยู่ภายในนิวเคลียส

จวบจนถึงปี 1953 มีคนอธิบายโครงสร้างของ DNA ได้ และจากนั้นก็เป็นช่วงเวลาที่กระบวนการแยก DNA เริ่มเกิดขึ้น และต่อมาในช่วงระหว่างปี 1960 และ 70 นักวิทยาศาสตร์ได้ทำการแยกชิ้นส่วนของเซลล์ออกมาและได้ค้นพบ RNA อีกอย่างที่มีรูปแบบและการทำงานที่หลากหลาย

ดังนั้นมันไม่เพียงพออีกแล้วที่จะแยก DNA ให้บริสุทธิ์โดยการแยกแค่โปรตีนและสารละลายเกลือที่ปนเปื้อนมา มันยังจำเป็นที่จะต้องกำจัด RNA ที่ปนเปื้อนอีกด้วย ในขณะเดียวกันนักวิทยาศาสตร์เริ่มให้ความสนใจในการสกัดเฉพาะ messenger RNA (mRNA) และจากนั้นไม่นานมันก็กลายเป็นสิ่งสำคัญที่จะสกัดให้บริสุทธิ์ ไม่เพียงแต่ DNA (จีโนมหรือพลาสมิด) เท่านั้น แต่ยังมี RNA ที่มีรูปแบบต่างๆกันอีกด้วย

วิธีการทำให้บริสุทธิ์ด้วยกรดนิวคลีอิกในช่วงแรกอาศัยการแยกแบบเกรเดียนต์ของความหนาแน่น (density gradient separation) ยุคต่อมาใช้การสกัดด้วย guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform ซึ่งใช้ประโยชน์จากความสามารถในการละลายที่ต่างกันของส่วนประกอบแต่ละอย่างของเซลล์ เนื่องจากแตกต่างกันในการละลายในสารละลายอินทรีย์หรือในน้ำ

เมื่อความเข้าใจเกี่ยวกับลักษณะทางเคมีของกรดนิวคลีอิกมีความลึกซึ้งมากขึ้น นักวิจัยหลายคนเห็นประโยชน์ของการแยกและศึกษาองค์ประกอบทางพันธุกรรม โดยมีเครื่องมือใหม่ๆพัฒนาออกมา เช่น solid-phase centrifugation columns คอลัมน์เหล่านี้ใช้ประโยชน์จากการเลือกจับอย่างจำเพาะต่อกรดนิวคลีอิกที่มีประจุลบ แล้วอาศัยความเข้มข้นของเกลือและค่า pH เพื่อแยกกรดนิวคลีอิกออกมา

และเมื่อไม่นานนี้เอง อนุภาคนาโนซุปเปอร์พาราแมกเนติก (superparamagnetic nanoparticles) ได้ถูกนำมาใช้สำหรับการสกัดกรดนิวคลีอิกให้บริสุทธิ์โดยการใช้แรงแม่เหล็กในการแยกสารพันธุกรรม

ขั้นตอนการสกัด DNA แบ่งเป็น 3 ขั้นตอน ดังนี้

1 . ทำให้เซลล์แตก (Cell lysis)

2 . กำจัดโปรตีน กรดนิวคลีอิกประเภทอื่นๆ เกลือ และเอนไซม์ย่อย DNA และ RNA (DNAase, RNAase) ที่ปนเปื้อน

3 . การชะ DNA หรือ RNA ที่จับคอลัมน์หรือแม่เหล็กอยู่กลับมา (Recovery)

ขั้นตอนที่ 1: ทำให้เซลล์แตก (Cell lysis)

ขั้นตอนแรกในการแยกกรดนิวคลีอิกคือการแยกผนังเซลล์ และ/หรือ เยื่อหุ้มเซลล์ออกเพื่อให้สารพันธุกรรมหลุดออกมา สามารถทำได้ด้วยการใช้ lysis buffer, homogenizer, ลูกบด bead mill, การแช่แข็งสลับละลาย (freeze thaw cycles) หรือการใช้คลื่นเสียง (sonication)

Lysis buffer ประกอบด้วยสารลดแรงตึงผิวที่จะไปสลายเยื่อหุ้มเซลล์และมีเอนไซม์เช่น protease K สำหรับย่อยส่วนประกอบโปรตีน ส่วนเครื่องบด homogenizer และ bead mill ทำให้เนื้อเยื่อและเซลล์ถูกทำลาย การสลายตัวของเซลล์ทำให้ทุกส่วนของเซลล์ปนกันในรูปสารละลาย ดังนั้น DNAases และ RNAases ที่มีอยู่จะเริ่มย่อยสารพันธุกรรม ซึ่งเราใช้สาร EDTA ในการยับยั้งการทำงานของ DNAase โดยการเข้าไปจับไออน (chelating divalent ions) ที่จำเป็นต่อการทำงานของเอนไซม์ DNAase ส่วน RNAases จะถูกทำลายด้วย beta-mercaptoethanol สุดท้ายเพื่อลดโอกาสของการปนเปื้อนด้วย RNAaeses หรือ DNAases ในกระบวนการ สิ่งสำคัญคือต้องใช้น้ำและบัฟเฟอร์ที่ได้รับการบำบัดด้วยสาร DEPC โดยผู้ปฏิบัติงานจะต้องสวมถุงมือและต้องรักษาพื้นที่ทำงานให้สะอาด

ขั้นตอนที่ 2 และ 3: กำจัดโปรตีน กรดนิวคลีอิกประเภทอื่นๆ เกลือ และเอนไซม์ย่อย DNA และ RNA (DNAase, RNAase) ที่ปนเปื้อน และการชะ DNA หรือ RNA ที่จับคอลัมน์หรือแม่เหล็กอยู่กลับมา (Recovery)

การสกัดด้วย Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform

เทคนิคการทำให้บริสุทธิ์เบื้องต้นนี้ใช้ประโยชน์จากการเลือกจับอย่างจำเพาะ ความสามารถในการละลายที่แตกต่างกันในตัวทำละลายอินทรีย์หรือในน้ำ และความไวต่อความเข้มข้นของเกลือ

การเติมฟีนอลและคลอโรฟอร์มในเซลล์ที่แตกตัวแล้วทำให้สารละลายตกในเฟสที่ไม่ละลายน้ำและเฟสที่ละลายน้ำ (hydrophobic phase and a hydrophilic phase) กรดนิวคลีอิกจะยังคงอยู่ในเฟสที่ละลายในน้ำ ในขณะที่โปรตีนจะอยู่ในเฟสที่ไม่ละลายในน้ำ

Guanidinium thiocyanate เป็นสารก่อความวุ่นวาย (chaotropic agent) ที่ขัดขวางการเกิดพันธะไฮโดรเจน ดังนั้นเมื่อใช้ guanidinium thiocyanate ในการสกัดฟีนอล – คลอโรฟอร์มจะช่วยแยก RNA และ DNA ออกจากกันโดยอยู่ในชั้นน้ำที่แตกต่างกัน

หลังจากการปั่นแยก RNA จะละลายอยู่ในชั้นน้ำด้านบน โดยมี DNA อยู่ด้านล่างและโปรตีนจะอยู่ในชั้นที่ไม่ชอบน้ำอินทรีย์ที่ด้านล่าง นอกจากนี้ Guanidinium thiocyanate ยังยับยั้งโปรตีนรวมถึง RNAases อีกด้วย

การตกตะกอนด้วยเอทานอลและคอลัมน์โซลิดเฟส(Solid phase column)

กรดนิวคลีอิกสามารถแยกออกมาได้โดยวิธีการตกตะกอนด้วยเอทานอล เทคนิคนี้ต้องใช้ solid phase ได้แก่ spin column ซึ่งเป็นระบบสนับสนุนแรกที่พัฒนาขึ้น คอลัมน์เป็นแบบ static แล้วสารละลายจะถูกเทลงไป ภายใต้ความเข้มข้นของเกลือและค่า pH ที่เหมาะสม กรดนิวคลีอิกจะจับกับคอลัมน์ขณะที่สารปนเปื้อนอื่นไหลผ่าน ขั้นตอนนี้อาศัยขั้นตอนหลายขั้นตอนและใช้การปั่นเหวี่ยงเพื่อกำจัดสิ่งปนเปื้อนก่อนที่จะทำการชะ DNA หรือ RNA ที่ต้องการในตอนท้าย

การสกัดกรดนิวคลีอิกด้วยแม่เหล็ก (Magnetic nucleic acid purification)

เมื่อเร็วๆนี้เองได้มีการใช้อนุภาค superparamagnetic และการใช้สนามแม่เหล็กเพื่อจับกรดนิวคลีอิก ประโยชน์ของวิธีนี้คืออนุภาคต่างๆมีอิสระที่จะเคลื่อนที่ไปรอบๆในการละลายซึ่งช่วยเพิ่มการดูดซับกรดนิวคลีอิกและเพิ่มประสิทธิภาพในการดักจับได้มากขึ้น

และโดยธรรมชาติของ superparamagnetic จะถูกแรงดึงดูดของแม่เหล็กที่มากระทำภายนอกและตรึงกรดนิวคลีอิกไว้ ในขณะที่โปรตีนและเกลือปนเปื้อนจะถูกชะล้างออกไป

ระบบแม่เหล็กนี้สามารถใช้ความเข้มข้นของเกลือและการตกตะกอนของเอทานอลก็ได้ หรือจะใช้สารเคมีที่ซับซ้อนมากขึ้นก็ได้ เพื่อดึงหรือแยก DNA และ RNA ในแบบเฉพาะเจาะจงหรือไม่เฉพาะเจาะจงก็ได้

ผลิตภัณฑ์ที่เกี่ยวข้อง

MAGTEC, NANO MAGNETIC BEADS FOR VIRUS EXTRACT DNA/RNA, BIOENTIST, THAILAND

MAGNETIC STAND, FG BEADS, JAPAN