การเตรียมตัวอย่าง Next-Generation Sequencing (NGS) : โดยคำแนะนำจาก 5 ผู้เชี่ยวชาญ

Share on facebook
Share on google
Share on twitter
Share on email
Next-generation sequencing (NGS) ทำให้นักวิจัยได้ข้อมูลทางพันธุกรรมอย่างรวดเร็วและมีประสิทธิภาพมากกว่าแต่ก่อน เมื่อมาถึงยุค NGS กุญแจหลักที่จะทำให้ได้ผลการทดลองที่ดีมีคุณภาพสูงนั้นมาจากขั้นตอนการเตรียมตัวอย่าง (library preparation) ที่ดี ซึ่งเราได้สอบถามผู้เชี่ยวชาญด้าน NGS จำนวน 5 ท่านเพื่อช่วยให้เราชั่งใจได้ว่า ควรทำอย่างไรจึงจะพัฒนากระบวนการเตรียมตัวอย่างสำหรับงาน next-generation sequencing ให้ดียิ่งขึ้น… และนี่คือคำแนะนำจากพวกเขา

สิ่งสำคัญที่ต้องใส่ใจเป็นพิเศษคือคุณภาพของตัวอย่างเริ่มต้น ไม่ว่าคุณจะเตรียมตัวอย่าง Library ของคุณได้ดีเพียงใด ผลลัพธ์สุดท้ายก็จะดีพอๆกับสิ่งที่คุณใส่เข้าไปตอนเริ่มต้นเสมอ นอกจากนี้คุณควรตรวจสอบให้แน่ใจว่าได้ทำตามคำแนะนำของชุดน้ำยาเตรียม Library ทุกครั้ง ชุดน้ำยาส่วนใหญ่อาจจะดีกว่าหรือแย่กว่าที่แสดงในสเปคก็ได้ แต่อย่างไรก็ความสำเร็จของการทดลองแต่ละครั้งมักจะเป็นเรื่องท้าทายอยู่เสมอ ดังนั้นควรทำการการทดลองซ้ำอย่างน้อยสามครั้งหรือมากกว่า เพื่อช่วยให้สามารถแยกแยะความแตกต่างได้ กรณีมีค่าที่ผิดปกติออกมา

—Ferris Jung, Research Technician แห่ง EMBL

คุณภาพของกรดนิวคลีอิกสำคัญมากกว่าทุกอย่าง การเลือกวิธีการทำให้บริสุทธิ์ไม่ใช่แค่เพียงแต่เน้นให้ได้ปริมาณ DNA หรือ RNA เยอะๆ แต่ต้องเน้นให้ได้สิ่งที่จำเป็นต้องใช้จริงๆมากกว่า กล่าวคือ จงใช้เวลาและความพยายามในการวัดคุณภาพและปริมาณตัวอย่างให้ได้อย่างเหมาะสม เพื่อลดการสูญเสียและเกิดผลลัพธ์ที่ไม่ดีในขั้นตอน sequencing

—Kurtis Knox, Senior Strategic Portfolio Manager แห่ง Promega

เพื่อให้ได้ผลดีที่สุดจากเทคโนโลยีการอ่านลำดับนิวคลีโอไทด์แบบสายยาว(long-read DNA sequncing) การเตรียมตัวอย่างเป็นองค์ประกอบที่สำคัญ วิธีการมากมายมุ่งเน้นไปที่การปรับกระบวนการให้ลดปริมาณจำนวน DNA เริ่มต้นให้มากที่สุด แต่ขั้นตอนสำคัญที่แท้จริงคือ:

• ต้องแน่ใจว่าได้มวลและขนาดต่างๆถูกต้องเหมาะสม ทั้งตัวอย่างเริ่มต้นและตัวอย่างในขั้นตอนสุดท้ายของการทำ library ในแง่ของคุณภาพตัวอย่างเริ่มต้น เป็นเรื่องสำคัญที่จะต้องเข้าใจเรื่องขนาด dsDNA(double strand DNA) และการกระจายตัวของขนาด (size distribution) เพื่อให้แน่ใจว่ามีปริมาณ DNA ที่เพียงพอต่อโครงการ และมีการกระจายตัวที่กว้างพอสำหรับงานวิจัยทั้งหมด ซึ่งความถูกต้องจากตรงนี้จะส่งผลถึง library ในตอนสุดท้าย ในการยืนยันปริมาณการเข้าจับของ polymerase ที่ตำแหน่งการจับของมัน (binding sites) ถ้าไม่วัดปริมาณให้ถูกต้อง ก็อาจจะทำให้มีการใช้ปริมาณ sequencing polymerase มากเกินไปหรือน้อยเกินไป ผลก็อาจจะไปเพิ่มสัญญาณ background และจากนั้นก็อาจจะนำไปสู่การเห็นปริมาณที่จริงลดลง

• จงปรึกษาผู้เชี่ยวชาญด้านการออกแบบการทดลองของคุณ เทคโนโลยีการอ่านลำดับพันธุกรรมแบบยาวและเทคโนโลยีที่เกี่ยวข้อง มีการพัฒนาและเปลี่ยนแปลงอย่างต่อเนื่อง ควรใช้คำแนะนำล่าสุดเกี่ยวกับการสกัด genomics DNA (gDNA), การวัดปริมาณ, การวัดขนาด, และการคัดเลือกขนาด ซึ่งสิ่งเหล่านี้เป็นข้อมูลที่สำคัญ

—Paul Kotturi, Director of Product Management at PacBio

เลือกชุดน้ำยาเตรียม library และรูปแบบการแปลผล (panel) ตามที่คุณต้องการ ปัจจัยที่จำเป็นต้องนำมาพิจารณา ได้แก่ สิ่งที่ต้องการจะทดลอง, ชนิดของตัวอย่าง, ประเภทของ DNA และปริมาณ, เครื่องอ่านลำดับพันธุกรรม (sequencing platform) และปริมาณข้อมูลที่เครื่องสามารถสร้างได้

•สำหรับตัวอย่างที่มีจำนวนจำกัด เช่นการตรวจชิ้นเนื้อหรือของเหลวตัวอย่าง คุณต้องเลือกผลิตภัณฑ์ที่มีประสิทธิภาพในการสกัดปริมาณดีเอ็นเอในปริมาณน้อยๆได้

•หากคุณวางแผนที่จะใช้เครื่องหาลำดับพันธุกรรมประเภทตั้งโต๊ะขนาดเล็ก เพื่อทำการศึกษาติดตามประชากรกลุ่มใหญ่ ขนาดของพาเนลและความสามารถในการปรับแต่งให้อ่านเฉพาะยีนที่เราสนใจ ก็เป็นเรื่องสำคัญ

•ตัวชี้วัดคุณภาพที่สำคัญ เช่น ความเข้มข้นของ DNA โดยรวม ปริมาณ DNA ปริมาณการเพิ่มจำนวนของ DNA และการกระจายขนาดความยาวของชิ้นส่วนดีเอ็นเอ ล้วนเป็นสิ่งสำคัญเพื่อให้แน่ใจว่าได้ผลลัพธ์ที่ถูกต้อง มีอัตราความล้มเหลวต่ำและมีระดับราคาที่แข่งขันได้

•หากคุณมีเครื่องหาลำดับพันธุกรรมที่ผลิตปริมาณข้อมูลได้มาก คุณอาจจะต้องเลือกน้ำยาเตรียม library ที่มีดัชนีแยกประเภทตัวอย่างให้หลากหลายมากขึ้น ซึ่งจะช่วยให้อ่านข้อมูลตัวอย่างได้หลายตัวอย่างมากขึ้น

•หากคุณใช้วิธีการแบบโซมาติก เพื่อตรวจหาการกลายพันธุ์ที่หายากมาก คุณจะต้องใช้ชุดน้ำยาเตรียมตัวอย่างที่สามารถวิเคราะห์และแก้ไขข้อมูลให้ถูกต้องได้ โดยใช้บาร์โค้ดระดับโมเลกุล

•สุดท้าย สิ่งที่ต้องนำมาพิจารณา ได้แก่ การตัดสาย DNA ทั้งแบบเชิงกลกับการตัดสายแบบใช้เอนไซม์ การเตรียมตัวอย่าง FFPE เวลาที่ใช้ทั้งหมด ราคาน้ำยาและอื่นๆ เมื่อถึงเวลาที่ต้องเลือก library prp มาใช้งาน

—Viresh Patel, Ph.D., Senior Director of Marketing, Genomics, Diagnostics and Genomics Group, Agilent Technologies

สิ่งที่สำคัญที่สุดในการเตรียมตัวอย่างสำหรับ NGS คือการรู้หรือสามารถวัดคุณภาพและความสมบูรณ์ของ DNA เริ่มต้น และการเข้าใจขั้นตอนการสร้าง library ให้เหมาะสม ทั้งในแง่ประสิทธิภาพการหาลำดับพันธุกรรมและวิธีการวิเคราะห์ผล

—Alex Vira, VP of Marketing at Sage Science