เทคโนโลยี Nanopore sequencing, bioinformatics และ applications (ep.1)

เทคโนโลยี nanopore เป็นเทคโนโลยีการหาลำดับ DNA และ RNA แบบสายยาวต่อเนื่อง ปัจจุบันได้มีการพัฒนาความถูกต้อง (accuracy) ความยาว (length) และปริมาณ (throughput) โดย nanopore sequencing สามารถนำไปศึกษา genome, transcriptome, epigenome และ epitranscriptome นอกจากนี้ยังได้ถูกนำไปประยุกต์ใช้ในงาน genome assembly, full-length transcript detection, base modification detection และอื่นๆ ได้ อีกด้วย

Oxford Nanopore Technologies (ONT) เป็นเทคโนโลยีที่ใช้โปรตีนที่มีลักษณะเป็นช่องในระดับนาโน (nanopore) ซึ่งมีคุณสมบัติเป็น biosensor โดย nanopore จะถูกนำไปติดอยู่บนแผ่นโพลีเมอร์ที่มีความต้านต่อกระแสไฟฟ้า และใช้สารละลาย electrolyte จากนั้นควบคุมแรงดันไฟฟ้าให้คงที่เพื่อที่จะสร้างกระแสไอออนให้ไหลผ่าน nanopore จากฝั่งประจุลบ ‘cis’ ไปยังฝั่งประจุบวก ‘trans’ ซึ่งความเร็วในการเคลื่อนที่ของ nucleic acid ที่ไหลผ่านจะขึ้นอยู่กับ motor protein

ในส่วนของ motor protein จะมี helicase activity ช่วยในการแยกสาย double-stranded DNA หรือ RNA-DNA duplexes ให้กลายเป็น single-stranded ที่สามารถไหลผ่านเข้าไปใน nanopore ได้ ซึ่งการเปลี่ยนแปลงของกระแสไอออนขณะโมเลกุลไหลผ่านตรงบริเวณที่ตรวจจับจะถูกประมวลผลด้วย computational algorithm แล้วแสดงผลออกมาเป็น nucleotide sequence ทำให้ได้ real-time sequencing ของ single molecule

หลักการของ nanopore sequencing โฟลว์เซลล์ (minION flow cell) จะมีแบ่งพื้นที่เป็น 512 ช่อง แต่ละช่องมี 4 nanopores ดังนั้นจะมี nanopores ทั้งหมดจำนวน 2,048 ตัว ที่สามารถใช้หาลำดับ DNA หรือ RNA ตัว nanopore นี้ถูกนำไปติดไว้ใน polymer membrane ที่มีความต้านทานไฟฟ้า ซึ่งเชื่อมต่อกับ sensor chip ที่แต่ละช่องมีอิเล็คโทรดแยกกันและวัดกระแสแยกกันด้วยอุปกรณ์ที่ชื่อว่า application-specific integration circuit (ASIC)
กระแสไอออนจะมีการไหลผ่าน nanopore อย่างต่อเนื่อง เนื่องจากมีการใส่ volt อย่างคงที่ระหว่าง membrane โดยมีการกำหนดให้ฝั่ง trans นั้นมีประจุบวก ส่วนอีกฝั่ง cis จะมี motor protein ที่ทำให้ double-stranded DNA (dsDNA) (หรือ RNA–DNA hybrid duplex) ถูกแยกสายออกจากกัน เกิดเป็น single-stranded DNA หรือ RNA ที่มีประจุลบ ทำให้สามารถเริ่มไหลผ่านเข้าไปใน nanopore ได้
เมื่อ nucleotides ผ่านเข้าไปใน nanopore จะเกิดรูปแบบกระแสที่วัดได้เป็นกราฟ แล้วจะถูกนำไปแปลงผลให้เป็น nucleotide แต่ละตัว โดยมีความเร็วในการอ่านประมาณ 450 เบสต่อวินาที (สำหรับ R9.4 nanopore)

แปลโดย : Champ Sarawut

ที่มา: Nature biotechnology review article (https://doi.org/10.1038/s41587-021-01108-x)