BioBlog

CRISPR: การปรับเปลี่ยนแก้ไขพันธุกรรมที่น่าทึ่งในศตวรรษที่ 21 เทคโนโลยี CRISPR เป็นหนึ่งในนวัตกรรมของวิศวกรรมชีวภาพในศตวรรษที่ 21 ซึ่งคุณอาจได้ยินถึงศักยภาพในการแก้ไข DNA และการรักษาโรคทางพันธุกรรม โดยนักวิทยาศาสตร์พัฒนาเทคโนโลยีนี้อย่างต่อเนื่อง และตอนนี้ยังมีสิ่งใหม่ให้เรียนรู้เพิ่มมากขึ้น ซึ่งบทความนี้จะกล่าวถึงบทสัมภาษณ์กับ Dr. Linyi Gao เกี่ยวกับเทคโนโลยีการแก้ไขโครงสร้างพันธุกรรมด้วย CRISPR  Dr. Linyi Gao ได้นำเสนอข้อมูลเกี่ยวกับการทำงานของ CRISPR ซึ่งสามารถนำไปใช้ในการแก้ไขพันธุ์สัตว์ พืช และจุลินทรีย์ได้ โดยมีการพัฒนาต่อเนื่องเพื่อเพิ่มประสิทธิภาพในการออกแบบ Guide

(Why You Should Automate Nucleic Acid Preparation) การเตรียมสกัดกรดนิวคลีอิคให้บริสุทธิ์ หรือ Nucleic acid isolation ถือเป็นเทคนิคพื้นฐานสำคัญที่ส่งผลต่อความน่าเชื่อถือของข้อมูล และผลที่ตามมาในการทดลองขั้นตอนอื่น ๆ

โครงสร้างที่มีการปรับเปลี่ยน (Structural variants (SV)) ในจีโนมของมนุษย์ มีความยาวประมาณ 1,000 base pairs เป็นที่รู้กันว่ามีความสำคัญหลายอย่างที่เกี่ยวข้องกับโรคหลายโรค เช่น ออทิสติก, โรคอ้วน, schizophrenia, และมะเร็ง

เรามาเริ่มจากการทำความรู้จักกับเทคโนโลยีการแยกและการทำให้บริสุทธิ์ของกรดนิวคลีอิกกันก่อน หรือเรียกอีกชื่อหนึ่งว่า “nucleic acid isolation and purification (NAIP) technologies” เทคโนโลยีนี้เป็นพื้นฐานแรกที่สำคัญและนำไปสู่การทดสอบและการประยุกต์ใช้ในงานวิจัยที่หลากหลาย รวมถึงกระบวนการหาลำดับพันธุกรรมแบบ long-read sequencing ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมานี้ เทคโนโลยีในการหาลำดับพันธุกรรมแบบ

การประยุกต์ใช้ Nanopore Sequencing การอ่านลำดับพันธุกรรมสายยาว ความสะดวกในการพกพา และความสามารถในการทำ direct RNA sequencing ของเครื่อง ONT นั้นช่วยในงานได้หลายด้าน (Fig. 5) Fig.

การตรวจหา DNA/RNA modifications เครื่อง ONT สามารถตรวจหาเบสที่ถูกดัดแปลง DNA/RNA modifications บางประเภทได้โดยตรง โดยการสังเกตความแตกต่างของสัญญาณที่เปลี่ยนแปลงจากเบสที่ไม่เกิดการดัดแปลง (Fig. 4, รูปตรงกลาง) แม้ว่าความละเอียดจะแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับว่ากำลังอ่านข้อมูลระดับปริมาณมาก (bulk

การวิเคราะห์ข้อมูลทางชีวสารสนเทศ (Bioinformatics) เมื่อใช้ข้อมูลจาก ONT ได้ผ่านการพัฒนามาอย่างต่อเนื่อง (Fig. 4). นอกเหนือจากการเก็บข้อมูลภายในและการใช้รูปแบบเฉพาะทางแล้ว การวิเคราะห์ด้วย ONT ส่วนมากจะเน้นไปที่การใช้สัญญาณ ionic current เพื่อจุดประสงค์บางอย่าง เช่น

กลยุทธ์เพิ่มเติมที่จะช่วยเพิ่มความถูกต้องให้แก่การหาลำดับเบส  นอกเหนือจากการพัฒนาในส่วน nanopore และ motor protein แล้ว ยังมีกลยุทธ์อีกหลายอย่างที่ถูกพัฒนาขึ้นเพื่อเพิ่มความถูกต้องในการหาลำดับเบส  คุณภาพของข้อมูลสามารถพัฒนาได้โดยการอ่าน dsDNA แต่ละสายซ้ำหลายๆรอบ เพื่อให้ได้ลำดับที่พบบ่อย (consensus sequence), คล้ายกับกลยุทธ์ที่ใช้กับ

การออกแบบของ ONT มีแนวคิดตั้งแต่ปี ค.ศ. 1980 ได้ค้นพบโปรตีนชนิดใหม่ที่มีลักษณะเป็นช่องเล็กๆระดับนาโน (nanopore) และโปรตีนที่มีความสามารถในการขับเคลื่อน nucleotide (motor protein)  โปรตีนที่มีลักษณะเป็นช่องนั้นชื่อว่า α-Hemolysin ซึ่งเป็นโปรตีนบนเยื่อหุ้มเซลล์ของเชื้อ Staphylococcus

เทคโนโลยี nanopore เป็นเทคโนโลยีการหาลำดับ DNA และ RNA แบบสายยาวต่อเนื่อง ปัจจุบันได้มีการพัฒนาความถูกต้อง (accuracy) ความยาว (length) และปริมาณ (throughput) โดย nanopore

ไวรัส African swine fever virus (ASFV) เป็นโรคติดเชื้อในหมู ซึ่งส่งผลกระทบต่ออุตสาหกรรมการเลี้ยงหมูและวงการอาหารในระดับโลก และเป็นโรคที่มีการเฝ้าระวังซึ่งประกาศโดยหน่วยงาน World Organisation for Animal Health (OIE)

RPA เป็นปฏิกิริยาที่ทำงานโดยใช้อุณหภูมิเดียว (isothermal) สามารถใช้ทดแทน PCR ได้ มีความสามารถในการเพิ่มจำนวนและตรวจสอบปริมาณ nucleic acid ที่ปกติต้องทำในห้องปฏิบัติการ เปลี่ยนมาให้ใช้ในภาคสนามได้สะดวกขึ้น Recombinase Polymerase Amplification (RPA)

Simple synthesis of functionalised magnetic beads for nucleic acid manipulation Protocol #1: Synthesis of ferrite

ปัจจุบันงานวิจัยทางด้านชีวโมเลกุลมีการมุ่งเน้นไปทางด้านการพัฒนาขั้นตอนการทำงานและเพิ่มความบริสุทธิ์ของกรดนิวคลีอิค (manipulation and purification of nucleic acid) โดยทั่วไปนิยมใช้หลักการของการ silica-base column ซึ่งในบางขั้นตอนการทำงานจำเป็นต้องใช้อุปกรณ์ที่มีจำเพาะ หรือใช้สารเคมีที่เป็นอันตราย อีกทั้งยังต้องใช้งบประมาณมากและไม่เหมาะต่อนำไปประยุกต์ใช้แบบ high-throughput ได้

Adjuvant คือสารที่ใช้ฉีดเข้าไปพร้อมกันกับ antigen เพื่อช่วยกระตุ้นระบบภูมิคุ้มกัน (immune) ให้สร้าง antibodies ที่ต่อสู้กับ antigen ชนิดนั้นได้มีประสิทธิภาพยิ่งขึ้น จุดประสงค์ของการใช้ Adjuvants      

1. ไมโครไบโอมในระบบทางเดินอาหาร (gut microbiome) คืออะไร ร่างกายมนุษย์สร้างขึ้นจากเซลล์หลากหลายรูปแบบ บางเซลล์เป็นเซลล์ของมนุษย์เอง เช่น เซลล์ผิวหนัง เซลล์เม็ดเลือด แต่นอกจากนี้มนุษย์เรายังเป็นแหล่งอาศัยของเซลล์สิ่งมีชีวิตอื่นๆ อีกเป็นจำนวนล้านล้านล้านเซลล์ ซึ่งได้แก่ แบคทีเรีย อาร์เคีย

Next-generation sequencing (NGS) ทำให้นักวิจัยได้ข้อมูลทางพันธุกรรมอย่างรวดเร็วและมีประสิทธิภาพมากกว่าแต่ก่อน เมื่อมาถึงยุค NGS กุญแจหลักที่จะทำให้ได้ผลการทดลองที่ดีมีคุณภาพสูงนั้นมาจากขั้นตอนการเตรียมตัวอย่าง (library preparation) ที่ดี ซึ่งเราได้สอบถามผู้เชี่ยวชาญด้าน NGS จำนวน 5 ท่านเพื่อช่วยให้เราชั่งใจได้ว่า

การสกัดสารพันธุกรรมหรือกรดนิวคลีอิกนั้นมีความไม่แน่นอนสูง เพราะ DNA นั้นบอบบางและฉีกขาดง่าย ส่วน RNA ก็ยิ่งบอบบางและฉีกขาดกว่านั้นอีก มีชุดน้ำยาจำนวนมากออกแบบมาเพื่อใช้ในงานนี้ แต่ปัญหาคือแต่ละครั้งที่สกัด DNA,RNA ก็ยังสกัดได้ในปริมาณไม่เท่ากัน บางครั้งได้ไม่มากพอหรือมีความบริสุทธิ์ไม่สูงพอ ห้องปฏิบัติการแต่ละแห่งมีวิธีการแตกต่างกัน เป้าหมายการทดลองก็แตกต่างกัน มันเป็นเรื่องที่น่าหงุดหงิดถ้าจะต้องมาเปลี่ยนชุดน้ำยาสกัดสารพันธุกรรมที่ใช้อยู่แล้วเป็นประจำ

การสกัดสารพันธุกรรม (Nucleic Acid Isolation) ความเข้าใจเกี่ยวกับสารพันธุกรรมของเราเพิ่มขึ้นอย่างมาก นับตั้งแต่ Friederich Miescher สกัด DNA เป็นครั้งแรกในปี 1869 เขาค้นพบว่ามีสารอยู่ภายในเซลล์ที่ตกตะกอนจากสารละลาย มีความเป็นกรดและละลายในสารละลายด่าง เขาเรียกมันว่านิวคลีอิน

Solid Phase Support Systems แบบเดิมนั้นเป็นลักษณะเรซิ่นหรือซิลิก้าบรรจุอยู่ในคอลัมน์(column) ซึ่งเรซิ่นหรือซิลิก้านี้ใช้สำหรับแลกเปลี่ยนประจุลบ พวกมันมีรูพรุนและยอมให้สารละลายไหลผ่านได้ แต่คอลัมน์ที่เป็นโซลิดเฟสที่แบบนี้ต้องอาศัยแรงปั่นเหวี่ยง(centrifugation) เพื่อบังคับให้สารละลายไหลผ่าน เมื่อไม่นานมานี้จึงมีการใช้อนุภาคแม่เหล็กเป็นระบบโซลิดเฟสแบบเคลื่อนที่ (mobile solid-phase support systems) มาใช้ในการจับ DNA,

ในบทความนี้ผมได้รวบรวมข้อมูลและประเด็นที่น่าสนใจ เพื่อที่จะช่วยให้ผู้ที่กำลังศึกษาข้อมูลในการ set lab ตรวจ GMO ทั้งเรื่อง เอกสารอ้างอิง ขั้นตอนการทำงาน รูปแบบการแปลผล รวมถึงการประมาณการลงทุน และราคาต่อตัวอย่าง เป็นต้น ผมหวังเป็นอย่างยิ่งที่จะเป็นประโยชน์ ไม่มากก็น้อยครับ

การสกัดกรดนิวคลีอิกให้บริสุทธิ์ด้วยแม่แหล็ก (Magnetic nucleic acid purification) การสกัด DNA หรือ RNA ด้วยแม่เหล็กให้บริสุทธิ์ขึ้นอยู่กับคุณสมบัติของอนุภาคซุปเปอร์พาราแมกเนติกในระดับไมโครหรือนาโน อนุภาคเหล่านี้มักจะสังเคราะห์จาก iron oxide กับสารแม่เหล็ก (magnetite)(Fe3O4)

ลูกค้าหลายท่านยังคงปวดหัวว่าจะเลือกวิธีการสกัด DNA แบบไหนดี ที่จะเหมาะกับ Lab ตัวเอง ผมขอเสนอความคิดเห็นส่วนตัว ไว้ให้ท่านได้ลองปรับใช้ในการตัดสินใจเลือกนะครับ เราสามารถแบ่งกลุ่มวิธีการสกัด DNA ได้คราวๆ 3 กลุ่ม คือ 1.